文章來源：H. Pahlevaninezhad , A. M. D. Lee , C. Hyun - Spie Bios – 2013 Proc. of SPIE Vol. 8565 85652S-2
本文以實驗結(jié)合光學軟件FRED來驗證熒光介質(zhì)上覆蓋散射層的影響，結(jié)合AF-OCT系統(tǒng)能夠減少由于上皮組織增厚引起的假陽性，增強AF疾病檢測的功效。
摘要：
在本文中，我們通過模擬組織的自發(fā)熒光（AF）特性進行了模型的研究。我們組合了光學相干斷層掃描（OCT）和AF成像系統(tǒng)，依據(jù)散射層的厚度和濃度來測量AF信號的強度。使用由生成的OCT圖像計算得到的厚度和散射濃度，結(jié)合AF-OCT系統(tǒng)能夠估計由上皮組織散射引起的AF損耗。我們定義了一個校正因子來計算上皮組織中的散射損耗，并且計算了一個校正散射AF信號。我們認為校正散射AF將會減少在早期呼吸道病變檢測中的診斷誤檢率，誤檢是由混合因子產(chǎn)生，如增加的皮層厚度和炎癥。
關(guān)鍵詞：光學相干斷層掃描；自發(fā)熒光；光散射；模型；光線光學；OCT A-line數(shù)據(jù)
1. 簡介
自發(fā)熒光（AF）成像是一項已實現(xiàn)的技術(shù)，使用藍光來激發(fā)自然組織熒光。通過收集高風險區(qū)域進行活檢識別，已經(jīng)證明這項技術(shù)對于癌癥的早期檢測和癌的分期是及其有效的。雖然通過白光成像可以容易的檢測浸潤癌，原位癌和高度的癌前病變的檢測卻十分棘手。白光成像中的變化十分微小，然而，AF成像可以清楚地對比這種病變。當受到藍光照射時，正常的組織會發(fā)出強烈的綠色AF，而異常組織則缺少這種AF輻射。
盡管AF成像可以方便的檢測原位癌，對于良性組織的異�，F(xiàn)象也是十分敏感的。例如，上皮組織的厚度未必就與癌癥相關(guān)，但是它確實減少了由散射產(chǎn)生的AF信號，導致了假陽性。因此，將癌癥與其他非危險異�，F(xiàn)象區(qū)別開來可以極大地增加治療的療效。
光學相干斷層掃描（OCT）是可以獲得生物組織皮下圖像的一項相干技術(shù)，它可以提供小于10μm軸向分辨率和大約3mm穿透深度的圖像。OCT采用了非電離，通常是近紅外的輻射來捕獲組織形態(tài)的實時圖像。OCT可以用于研究高風險的組織位置。因此，當用于組合時，以一種同時和協(xié)作的形式，AF-OCT成像可以提供豐富的生化信息，并定位組織形態(tài)，這些不能通過單獨的成像模式獲得。比如，在上皮組織增厚的情況下，OCT可以直接測量上皮組織厚度，并且將AF信號衰減歸因于上皮增厚，而不是癌癥前期引起的膠原重建。因此，由OCT給定結(jié)構(gòu)信息，并結(jié)合AF-OCT可以減少AF假陽性。
AF信號強度不僅取決于原位的熒光，也取決于不同組織層的光吸收和散射。組織的光散射已經(jīng)經(jīng)過了深入的研究1-6。模擬組織散射可以提供與AF信號強度有價值的信息。由于價格低廉、方便校準且易于獲得，英脫利匹特（Intralipid）是用于組織模型最常見的散射媒介。這項工作的目的是根據(jù)散射層的厚度模擬組織自發(fā)熒光的性質(zhì)。我們定義了一個AF信號校正因子，用來說明散射層引起的損耗。OCT圖像給出了散射層厚度和散射顆粒的濃度，這是校正因子計算所需的兩個因素。因此，我們提出了AF-OCT系統(tǒng)，作為癌癥檢測的一個更靈敏和精確的成像工具。
首先，我們解釋了Intralipid模型研究，旨在模擬不同上皮厚度的組織散射特性。然后，使用光線光學仿真來驗證實驗結(jié)果。使用AF和OCT數(shù)據(jù)計算AF校正因子將在最后一章解釋。
2. 實驗步驟
我們建立了一個能夠結(jié)合OCT和AF成像的雙態(tài)成像系統(tǒng)，OCT圖像測量Intralipid膜的厚度和濃度，AF圖像給出相應的AF信號強度。因此，AF-OCT成像可以映射不同濃度下AF強度和Intralipid厚度的關(guān)系。
OCT光激發(fā)使用一個30mW基于多邊形掃描儀的掃描波長的激光光源，具有106.8nm的帶寬，中心波長為1321.4nm。 激光光源為一個基于光纖的具有參考臂和樣品臂的馬赫澤德干涉儀（MZI），如圖1所示（OCT部分）。平衡的光電探測器（ThorLabs）檢測干涉。另一個MZI單元在光源處使用，來產(chǎn)生樣品的參考時鐘。探測器輸出和MZI時鐘注入到數(shù)字轉(zhuǎn)換器卡（AlazarTech）中，實現(xiàn)信號處理和創(chuàng)建OCT圖像。
AF成像系統(tǒng)使用一個40mW的半導體激光器（相干），在446nm處激發(fā)熒光。使用兩個1英寸直徑的透鏡和一個基于APD的探測器（Hamamatsu）來收集再發(fā)射的AF光子。二向色性的濾波片從AF光子中分離出后向散射的藍光，如圖1所示（AF部分）。通過在自由空間的背面拋光寬板電介質(zhì)反射鏡（ThorLabs），OCT和AF光信號可以實現(xiàn)結(jié)合和分離。電流掃描鏡提供了樣品AF和OCT光束共同的2維掃描。
圖1.AF-OCT成像系統(tǒng)
我們的模型，如圖2（b）所示，包括一個直徑為1英寸的�。�1mm高）圓柱壁，它安裝在一個熒光載玻片上，以及圓柱壁中包圍著的Intralipid液體。改變?nèi)萜髦蠭ntralipid的量會產(chǎn)生不同的Intralipid膜厚度，由OCT圖像測得。選擇封閉的圓柱壁時，高度要低，直徑要大，這樣就可以得到小的Intralipid膜厚度（μm范圍），同時在容器的中心區(qū)域可以接近扁平的表面以避免半月板和透鏡效應。圖2（a）顯示了在熒光載玻片上Intralipid膜的AF信號和OCT圖像。Intralipid膜的厚度和相對應的AF信號可以從圖中容易地獲得。
圖2.（a）在熒光載玻片上Intralipid膜的AF信號和OCT圖像，（b）Intralipid模型由在熒光載玻片上的圓柱壁及其中包含的Intralipid組成。
3. 光線光學仿真
使用來自Photon Engineering公司的商業(yè)軟件包FRED，我們將實驗的結(jié)果與光線光學仿真的結(jié)果進行比較。圖3顯示了仿真的配置和組件，包含一個藍色的激光光源（446nm）、一個熒光載玻片、一個Intralipid膜、用于聚焦藍光到樣品上和收集重新發(fā)射的AF光子的1英寸透鏡（焦距40mm）、一個遠離透鏡50cm的探測器，模仿實驗的裝置。探測器只對大于500nm的波長敏感，以此分離AF光子和后向散射的藍光。
熒光載玻片由一個散射介質(zhì)模擬，對于每個具有425nm–490nm波長范圍的入射光子，通過散射介質(zhì)的“平均自由程”后，散射介質(zhì)會在隨機方向重新發(fā)射一個550nm的光線。使用數(shù)量巨大的光線，重新發(fā)射光子的隨機方向模仿由點光源產(chǎn)生的球面波，等價于熒光輻射。平均自由程決定了入射光滲透到載玻片內(nèi)部的深度。Intralipid膜由具有各向異性（g）和散射系數(shù)（(μs）的Henyey-Greenstein體散射模型來模擬。
圖3.包含一個熒光載玻片、一個Intralipid膜、一個1英寸透鏡、一個激光光源和一個探測器的光線光學仿真裝置。
4. 結(jié)果和討論
圖4（a）比較了10% Intralipid實驗結(jié)果和光線光學的仿真結(jié)果。Intralipid模型仿真需要散射參數(shù)（g, μs）。散射系數(shù)7-19的理論計算和實驗測量在許多論文中已經(jīng)提出。然而，文獻中報道的g和μs的值是變化的。我們使用在引用最多的文章中提出的數(shù)值來運行仿真，也就是van Staveren, et al8、Michels, et al17和Flock, et al19。在實驗和仿真的情況下，所有的AF信號都歸一化沒有Intralipid膜的AF數(shù)值，來隔離Intralipid膜對AF信號的影響。使用由Flock, et al19給出的Intralipid散射參數(shù)，我們實驗結(jié)果顯示出與仿真結(jié)果幾乎完美的匹配。然而，使用van Staveren, et al8和Michels, et al17提出的散射參數(shù)，比我們實驗測量建議產(chǎn)生了更多的AF損耗。
圖4.（a）AF信號隨Intralipid厚度變化曲線，來自實驗（藍色圓）和對10%Intralipid使用由Flock（紅色方塊）、van Staveren（綠色三角）和Michels（紫色方塊）提出的散射參數(shù)的光線光學仿真，（b）對于不同的Intralipid濃度，實驗AF信號隨Intralipid厚度變化曲線。
圖4（b）是對于不同的Intralipid濃度， 實驗AF信號隨Intralipid厚度變化曲線。正如預期，20%的Intralipid會引起激發(fā)藍光的劇烈散射，重新發(fā)射AF會隨著Intralipid厚度的增加急劇下降，然而，在較低的Intralipid濃度處，AF信號的損耗是比較少的。知道了Intralipid濃度，圖4（b）記錄了Intralipid膜引起的信號衰減，這可以用于AF校正因子。因此給定一個Intralipid濃度，AF信號的校正因子可以從圖4（b）中估計得到。
根據(jù)事實高濃度會導致嚴重的信號振幅的衰減，OCT A-scan數(shù)據(jù)可以給出Intralipid濃度，然而，對于低濃度這種衰減很低。圖5（上）顯示了不同濃度下的OCT A-scan。A-scan數(shù)據(jù)（藍色圓）曲線擬合到e-at函數(shù)（綠色實線），產(chǎn)生衰減系數(shù)（a）隨Intralipid濃度的變化曲線，如圖5（下）所示。OCT數(shù)據(jù)可以測量散射顆粒（圖5b）的濃度，有助于找到圖4中對應的曲線。舉個例子，具有2.6mm-1OCT A-line損耗的樣品對應于大約5%的濃度的散射顆粒。因此，AF校正因子可以由圖4（b）的紅色曲線確定。所以對于觀察到的AF信號，AF-OCT系統(tǒng)提供了足夠的信息來計算校正因子，從而可以用于減少較厚散射層引起的AF假陽性。
圖5.上：OCT A-line數(shù)據(jù)（圓）曲線擬合到e-at（綠色實線），下：從OCT A-line數(shù)據(jù)得出的損耗系數(shù)a隨Intralipid濃度的變化曲線。
5. 結(jié)論
我們進行了一項Intralipid模型研究，使用組合的AF-OCT系統(tǒng)模擬了熒光介質(zhì)上覆蓋散射層的影響。對于不同的散射顆粒的濃度，呈現(xiàn)出隨著散射層厚度變化的AF損耗曲線。OCT成像用于計算散射層厚度和濃度，以及估計AF信號損耗所需的參數(shù)。模型用于從散射層引起的損耗計算AF信號衰減的校正因子。因此，結(jié)合AF-OCT系統(tǒng)能夠減少由于上皮組織增厚引起的假陽性，增強AF疾病檢測的功效。
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